尝试筹备： 细胞 ，24孔板 ，细胞幼室（8μm ，24孔板专用） ，ECM Gel ，10%FBS+造就基 ，无血清造就基 ，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头 ，1.5 mL EP管 ，冰盒
尝试设计：
尝试分组通常分为
阴性组（高低层均没有趋化成分） ，
尝试组（依照尝试必要 ，上层或者基层参与趋化成分） ，
对照组（趋化成分与尝试组中的相反） 。若是有出格必要 ，能够再加上
阳性组（高低层都有趋化成分） 。
尝试操作（请细读当苦衷项）：
一、细胞侵袭尝试
1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻 ，尝试前转移到冰盒中 。
2.将1.5 mL EP、枪头河注细胞幼室放在24孔板里面后 ，置于冰上预冷 。
3.凭据自己的使用量 ，依照ECM Gel : 无血清造就基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液 。
4.把枪头剪去一幼段（约3 μm）后在冰上汲取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻参与幼室上室中 ，参与时慢慢移动枪头 ，保障液体平铺在底部 。
5.放在37 ℃孵箱15 min ，让胶凝固 。
6.消化、离心、计数细胞后 ，依照2.5x10^4 / mL用无血清造就基稀释细胞 ，造成细胞悬液（若是细胞好多 ，这一步能够提前 ，在4、5之前做） 。
7.依照每孔200 μL ，将细胞悬液参与幼室上室 ，同时在幼室下室参与10%FBS+造就基500 μL ，放入37 ℃孵箱造就 。
8.若干幼时后取出 ，吸去幼室上室有余液体 ，用PBS洗濯两次 ，用棉棒在上室中轻轻动弹 ，吸干水分并擦去膜内侧的细胞 。
9.在上室中参与结晶紫染液 ，染色5 min ，回收染液 ，用流水缓缓冲去染液 ，再次用棉棒在上室中轻轻动弹 ，吸干水分 。 10.在正置显微镜上搁置一块载玻片 ，将细胞幼室的幼孔颠倒放在上面 ，拍照 。
11.在100倍视野下 ，对膜的高低左右及中央计数 ，做均匀数 。
二、细胞迁徙尝试
细胞迁徙尝试不必要ECM Gel包被 ，其余步骤一致 。
尝试道理：多孔膜是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane） ，膜带有微孔 ，孔径大幼有0.1－12.0 μm 。将细胞幼室放入对应的造就板中 ，幼室内称上室 ，造就板内称下室 ，上室内盛装上层造就液 ，下室内盛装基层造就液 ，高低层造就液以聚碳酸酯膜相隔 。将细胞种在上室内 ，由于聚碳酸酯膜有通透性 ，基层造就液中的成分能够影响到上室内的细胞 ，从而能够钻研基层造就液中的成分对细胞成长、活动等的影响 。
细胞迁徙和侵袭尝试常用8.0μm膜 ，上室种肿瘤细胞 ，下室参与FBS或某些特定的趋化因子 ，肿瘤细胞会向营养成分高的下室活动 ，从而从多孔膜一侧穿过 ，贴壁于多孔膜的另一侧 ，计数其细胞量可反映肿瘤细胞的迁徙或者侵袭能力（圆形通明幼孔为微孔） 。（注：迁徙和侵袭是两个概想 ，迁徙是指细胞的活动能力 ，而侵袭是细胞在活动的同时会排泄出消化ECM的蛋白 ，断根活动阻碍 ，这个尝试更能模拟人体内环境）
当苦衷项
1.ECM Gel（货号：E1270）由Sigma公司出产 ，起源于大鼠赘瘤的细胞表基质提取物 ，保留在-20℃ ，由于在室温中会急剧凝固 ，不成逆 ，因而必要在冰上溶化和操作 ，同时所有要与ECM Gel接触的耗材也必要预冷 ，预防俩者接触时温差较大引起ECM Gel凝固粘附 ，造成浪费 。
2.造作ECM Gel使用液时 ，先参与造就基 ，再参与ECM Gel；同时在使用量的基础上多配置5-20 uL（使用量多就多配点） ，预防液体挂壁造成最后一次加样不够 。
3.加胶时 ，胶的量以刚好把胶浸湿为最好（24孔的millicell必要35-40uL） ，过厚细胞侵袭变慢 ，过少则失去侵袭尝试的意思；实现后可轻轻地 ，均匀地拍打造就板四个侧面 ，让液体齐全平铺 ，这样能够预防由于胶的厚薄不均而引起的误差 。
4.凝固功夫能够适当耽搁 ，但最好不要超过30min ，预防液体挥发使gel凝固得过硬 。
5.通常先凭据细胞的侵袭能力估计每孔幼室参与的细胞数量 ，侵袭能力强的细胞（如231 ，CAF）每孔参与5,000个 ，那最后的细胞悬液应该造备成2.5x104/mL ，而侵袭能力弱的细胞（如MCF-7）能够提高细胞数量 ，达到10,000个 ，那最后的细胞悬液应该造备成5x104/mL 。上层参与细胞悬液后可轻轻地 ，均匀地拍打造就板四个侧面 ，让液体齐全平铺 ，预防细胞散布不均而引起细胞计数时中央多双方少 。
6.参与下室中的10%FBS是作为趋化因子诱导细胞活动 ，24孔板下室通常参与500μl含FBS的造就基 ，分歧的造就板加的量有分歧要求 ，具体请参考说明书 。这里要出格把稳的是 ，基层造就液和幼室间�；嵊衅莶� ，一旦产生气泡 ，气泡处的趋化作用就减弱甚至隐没了 ，在种板的时辰要出格留心 ，幼室在放入时倾斜缓慢放入（把稳幼室中的液体不要流出） ，能够预防气泡 。造就功夫必要自己凭据文件做预尝试 ，寻找相宜的功夫点；功夫点的选择除了要思考到细胞细胞侵袭力表 ，细胞数及处置成分对细胞数主张影响也不成忽视 ，穿过的细胞数在100-200之间最好 。棉签洗濯时肯定要柔和 ，预防戳破多孔膜 。
7.结晶紫是细胞核染液 ，细胞大幼分歧 ，染色功夫也有扭转 ，染液搁置的功夫和浓度也会对染色功夫有影响 ，必要自己把握；最优的染色状态是细胞核色彩深 ，胞浆色浅 。
