划沉点：
1.iPSC造就过程中不建议使用抗生素，抗生素会影响细胞的活性和分化潜能 。
2.iPSC造就环境应与其它细胞隔离，两次传代后检测支原体 。
01基质胶用于多孔板的包被：
（1）将Gelnest?基质胶(干细胞专用)置于冰中并在4℃消融，使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态 。
注：GelNest?基质胶是由幼鼠肿瘤组织中提取的基底膜成分造备而成，蕴含的重要成分有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白硫酸肝素糖蛋白等，更含有多种多种成长因子 。这些成分能够提供细胞黏附、分化和增殖所需的支持和信号，模拟生理环境中基底膜的个性，从而进一步模拟生理环境中的细胞信号通路和互动，提高细胞造就的成功率和成效 。
（2）在冰上，将基质胶与DMEM造就液依照1:80或1:100的比例混匀，例如取1mL基质胶参与80mL或100mL DMEM造就液中，使用预冷的移液管混合至均匀状态 。
注：可凭据尝试具体情况调整稀释比例 。
（3）将6孔板置于冰上，依照每孔1mL向6孔板中参与稀释后的基质胶 。
（4）将6孔板置于37℃孵育过夜 。
注：通常情况下，孵育1幼时即可使用，但过夜孵育的细胞造就成效更好 。
（5）使用前吸出未结合的基质胶 。
注：需确保移液管的尖端不会刮伤涂层表表 。
02 Y-27632 （ROCK抑造剂）溶液的配造
将Y-27632 溶于PBS中，配造成10mM的Y-27632溶液，例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中，即得1mL 10mM Y-27632溶液 。
注：Y-27632的工作浓度为10?M 。
03配造含Y-27632的人胚胎干细胞造就液（如mTeSR?1或TeSR?-E8?）
取Y-27632溶液与mTeSR?1造就液依照1:1000的比例混匀，例如取10?l Y-27632溶液参与10mL mTeSR?1造就液中，即得10mL含10?M Y-27632的mTeSR?1造就液 。
04 iPSC复苏：
（1）将冻存的iPSC置于37℃水浴迅速解冻，将细胞溶液转移至离心管中，用DMEM造就液冲刷冻存管两次并转移至离心管中，与管中细胞归并，室温300×g离心5分钟 。
（2）弃上清，用2mL含Y-27632的mTeSR?1造就液沉悬iPSC，随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板的1个孔中，置于造就箱中造就 。
注：建议将每支复苏的细胞(约100万个)转移至6孔板的1个孔中造就使细胞存活率最大化 。
（3）第二天对iPSC进行换液，将含Y-27632的mTeSR?1造就液更换为不含Y-27632的mTeSR?1造就液 。
注：可使用J9集团国际站新推出细胞复苏仪代替原始细胞复苏过程，细胞复苏功夫短，细胞存活率高 。
05 iPSC传代：
注：iPSC细胞成长至单层后会迅速分化并殒命，为维吃熹活性和多能性，需在长满前进行传代 。
（1）去上清，用1mL PBS洗涤1次，参与1mL适当的细胞消化液
（2）将造就板转移至造就箱中孵育3分钟 。显微镜下观察，大部门细胞脱落，若细胞仍附着，能够用手轻轻拍打造就板底部使细胞脱落 。
（3）将消化下来的细胞转移至离心管中，用DMEM造就液洗涤造就板表表两次并转移至离心管中，与管中的细胞归并，室温300×g离心5分钟 。
（4）弃上清，用含Y-27632的mTeSR?1造就液进行沉悬，随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板中，置于造就箱中造就 。
06iPSC冻存：
NEST生物样本库系列含有全规格细胞冻存管及冻存液，操作单一，安全无菌 。
（2）参考细胞冻存液的有关步骤进行细胞消化 。
（3）计数，弃上清，参与适量冻存液，以每管1mL冻存液（约100万个细胞）分装至冻存管中 。
（4）将细胞冻存管搁置于可逐步降低温度的NEST法式降温盒内并搁置在-80℃冰箱内，确保冷却速度约为1℃/分钟 。通常冷却速度不宜快于0.5℃/分钟 。
（5）搁置在-80℃冰箱内约24幼时后转移至液氮气相中保留 。
iPS细胞的成功诱导给细胞医治及再生医学钻研启发了全新的路路 。相信在不久的将来，iPSC技术能急剧突破瓶颈，NEST也将持续研发新品，推动再生医学的蓬勃发展，为患者带来新生的但愿！
